Microarreglos de ADN
La plataforma de genómica integrativa funciona en la Unidad de Biología Molecular (UBM) con equipamiento adquirido en conjunto con el Instituto Nacional de Investigaciones Agropecuarias (INIA) y el Laboratorio Tecnológico del Uruguay (LATU).
Equipamiento disponible
La plataforma de genómica integrativa cuenta con todo el equipamiento necesario para la realización de un experimento de microarreglos de ADN.
Escáner de microarreglos
El escáner de microarreglos de la firma Agilent Technologies mide la intensidad de fluorescencia de los ácidos nucleicos (ADN o ARN) marcados que se unen al microarreglo. Es capaz de medir la fluorescencia de dos fluorocromos diferentes (Cianina: 3-CTP y 5-CTP) en simultáneo facilitando los estudios de expresión diferencial.
Cada microarreglo es escaneado en minutos y genera archivos con la información obtenida.
Las características del escáner son las siguientes:
- Resolución: 5 o 10 micrones
- Escaneo con dos intensidades (Dual Scan Extended Dynamic Range)
- Autofoco dinámico
- Estabilización de láser continua
- Compresión de imágenes en formato TIFF
El escáner permite la lectura tanto de microarreglos producidos por Agilent como de microarreglos caseros o producidos por otras compañías.
Microarreglos
Agilent cuenta con microarreglos prediseñados para diversas aplicaciones, de diversos organismos.
Los microarreglos de Agilent contienen oligonucleótidos de 60 pb (60-mer) sintetizados in situ mediante la tecnología SurePrint
Además de los microarreglos prediseñados para las diferentes aplicaciones y organismos, la plataforma Agilent permite la síntesis de cualquier tipo de microarreglo adaptado a las necesidades particulares de cada proyecto de investigación: Custom Microarrays. El usuario puede diseñarse su propio microarreglo a través del software gratuito y vía web eMicroarray5.0., y enviar el diseño a través de la web a Agilent para su fabricación.
Formatos
Listado de los microarreglos que dispone Agilent para realizar análisis de expresión génica:
| Código | Diseño | Descripción |
| G4112F | 014850, 44K | Whole Human Genome Microarray Kit |
| G4122F | G4122F, 44K | Whole Mouse Genome Microarray Kit |
| G4131F | G4131F, 44K | Whole Rat Genome Microarray Kit |
| G2519F | 015059, 44K | Arabidopsis 3 |
| G2519F | 015354, 44K | Bovine |
| G2519F | 015067, 44K | Canine |
| G2519F | 015061, 44K | C.Elegans |
| G2519F | 018972, 44K | Drosophila |
| G4813A | 020097, 15K | E.Coli |
| G2519F | 015068, 44K | Gallus (chicken) |
| G2519F | 015060, 44K | Magnaportha grisea 2 |
| G2519F | 015062, 44K | Mouse development |
| G2519F | 020109, 44K | Porcine |
| G2519F | 015421, 44K | Rhesus Monkey |
| G2519F | 015058, 44K | Rice |
| G4813A | 019921, 15K | Sheep |
| G2519F | 015066, 44K | Xenopus |
| G2519F | 015072, 44K | Yeast |
| G2519F | 015064, 44K | Zebra fish |
Otros tipos de análisis posibles (además del análisis de expresión génica) mediante la técnica de microarreglos:
- microRNAs
- CGH (Comparative Genomic Hybridization)
- DNA Methylation
- Chip-on-Chip
El servicio de microarreglos incluye
- Orientación en la planificación del experimento a realizar
- Control de calidad de las muestras con el bioanalizador 2100 Bioanalyzer.
- Reactivos y protocolos de marcaje, hibridación y lavado (Agilent)
- Escaneo de microarreglos con el escáner de Agilent
- Análisis de imagen y cuantificación de datos de fluorescencia con el Software Feature Extraction
- Análisis básico de resultados mediante el software GeneSpring de Agilent
Funcionamiento del servicio
El primer paso para la realización de experimentos de microarreglos consiste en rellenar el formulario de solicitud en el que se detalla: el tipo de microarreglo, el número de hibridaciones por muestra, marcaje con uno o dos colores, muestras experimentales y de referencia, experimentos de dye-swap, así como una descripción del proyecto. Dicho formulario deberá ser enviado por correo a ubm (arroba) pasteur.edu.uy, y será evaluado con el fin de determinar el correcto diseño del experimento.
A continuación se enviará un mail al usuario con el fin de concretar una reunión en la cual se discutirán todos los detalles referentes al experimento y se acordará una fecha del envió de las muestras por parte del usuario para su posterior análisis: ARNs experimentales y de referencia ya purificados.
Extracción de ARN
- Para la extracción del ARN de tejidos y células sanguíneas se recomienda la combinación de la extracción con Trizol seguido de una purificación en columna (por ejemplo las columnas RNeasy Mini Kit de QIAGEN).
- Para células en suspensión o cultivos celulares se recomienda la extracción de ARN con columnas.
Requerimiento mínimo del ARN
Puesto que la pureza e integridad del ARN de partida es clave para el éxito del experimento, se recomienda al usuario observar la integridad del mismo en un gel de agarosa. Si se observa degradación o contaminación con ADN genómico, la muestra no podrá ser utilizada en los experimentos de microarreglos.
Se requiere 2 ug RNA total para marcaje con un color y 5 ug para marcaje con dos colores, a una concentración de 200ng/uL, disuelto en agua ultrapura libre de RNasas. Si no es posible conseguir dichas cantidades consulte con la unidad. Las muestras deben estar correctamente identificadas con el nombre como consta en el formulario (conservadas a -20ºC). Las muestras recibidas serán cuantificadas en un espectrofotómetro (nanodrop) y su calidad determinada mediante el bioanalizador 2100 (Agilent Technologies). Cualquier problema detectado en este control de calidad será comunicado al usuario para su posible solución.
El ARN debe tener una buena calidad respecto a la pureza, integridad y contaminación de ADN genómico. Requerimientos mínimos de calidad: A260/280 >= 1.8, 28S/18S>=1.2; RIN:7
Una vez que las muestras superen el primer control de calidad se procederá con el marcado del ARN, la purificación e hibridación de los microarreglos.
Análisi de imagen
Se refiere a la interpretación de la información del microarreglo (sondas, genes, anotación), ajuste del background, control de calidad y normalización de los datos.
Se utilizará el software comercial de Agilent Feature Extraction. La combinación del escáner de Agilent con dicho software, permite el análisis de microarreglos no sólo Agilent, sino también los sintetizados por otras plataformas y que impliquen marcaje con los fluorocromos Cianina: 3-CTP y 5-CTP.
Análisis de resultados
El servicio de análisis de resultados incluye hasta la identificación de genes expresados diferencialmente con significancia estadística.
Para realizar otros tipos de análisis tales como: Clustering (descubrimiento de perfiles o patrones de expresión comunes y diferenciales), Pathways (análisis de procesos biológicos y vías de señalización implicados), estudios de redes de interacción entre genes, etc., el usuario tendrá las siguientes opciones:
- Utilizar el Software GeneSpring de Agilent en el Instituto Pasteur por un máximo de 16 horas
- Solicitar el análisis a la UBI-Unidad de Bioinformática (a convenir con la UBI).
Entrega de resultados
El servicio entregará los resultados en formato de CD que incluirá:
- Los protocolos seguidos para el procesamiento de microarreglos.
- Los resultados del control de calidad de las muestras con el Bioanalizador 2100
- Imágenes del escaneo en formato tiff y jpeg
- Raw data: archivos originales generados por el software Feature Extraction
- Datos normalizados: formato .txt generado por GeneSpring
- Listas de genes diferencialmente expresados
Contacto
Por consultas técnicas:
E-mail: ubm (arroba) pasteur.edu.uy
Por contratación de servicios:
E-mail: tecnología (arroba) pasteur.edu.uy
Teléfono: 5258049 int. 125
Envío de muestras por correo:
Institut Pasteur de Montevideo
Unidad de Biología Molecular
Mataojo 2020
CP. 11400
Montevideo, Uruguay